Project

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Metabolic regulation by conformational changes in an electron transfer protein.

English title Metabolic regulation by conformational changes in an electron transfer protein.
Applicant Pandey Amit V.
Number 204518
Funding scheme Project funding (Div. I-III)
Research institution Universitäts-Kinderklinik Universität Bern
Institution of higher education University of Berne - BE
Main discipline Biophysics
Start/End 01.12.2021 - 30.11.2025
Approved amount 720'000.00
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All Disciplines (2)

Discipline
Biophysics
Organic Chemistry

Keywords (5)

Single Molecule studies; electron transfer; protein conformation; Redox biology; SmFRET

Lay Summary (German)

Lead
Stoffwechselregulation durch Konformationsänderungen in einem Elektronentransferprotein.
Lay summary

Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (POR) ist ein Enzym, das für den menschlichen Stoffwechsel essentiell ist. Genetische Mutationen in POR verursachen Störungen des Steroidstoffwechsels. Die Forschungsarbeiten von Pandey und anderen haben die Grundlage dafür gelegt, dass POR als zentraler molekularer Hub fungiert, um selektiv Stoffwechselkaskaden zu aktivieren.

 

Die mechanistischen Details des Zusammenspiels zwischen biochemischen Inputs, Proteinen und nachgeschalteten Effektoren für die POR-Aktivität in der Pharmakologie und Stoffwechselkontrolle sind nicht klar. Das zentrale Ziel dieses Projekts ist es, ein detailliertes Verständnis der schwer fassbaren Rolle der Strukturdynamik auf die POR-Aktivität zu erlangen und zu beantworten, wie pathogene Mutationen und regulatorische Einflüsse POR kontrollieren. Wir werden diese Erkenntnisse nutzen, um Chemikalien zu erforschen, die auf POR abzielen, um Stoffwechselstörungen zu behandeln.

 

Zell- und biochemische Studien in Bern, Schweiz, werden das CRISPR/CAS-System verwenden, um das menschliche P450-Reduktase-Gen in Zellen zu bearbeiten, um Modelle menschlicher Mutationen für die Untersuchung von Steroidstörungen zu erstellen. Wir werden rekombinante Formen von humanem POR in Bakterien herstellen, um die Enzymkinetik und Interaktion mit Partnerproteinen zu untersuchen. Einzelmolekülstudien in Kopenhagen, Dänemark, werden über klassische Assays hinausgehen, die das durchschnittliche Verhalten einer großen Anzahl von nicht synchronisierten Proteinen aufzeigen. Einzelmolekül-Funktionsstudien ermöglichen die direkte Beobachtung einzelner Katalysezyklen. Mithilfe von Enzymkinetiken, Zellmodellen und Einzelmolekülstudien werden wir ein konformatives Verständnis genetischer Variationen in POR generieren, die Krankheiten verursachen oder zu Unterschieden im Arzneimittel- und Steroidmetabolismus führen.

 

Das Potenzial der direkten und synchronen Beobachtung der strukturellen und funktionellen Dynamik eines Enzyms bei der Arbeit verspricht aufzudecken, wie strukturelle Dynamik die biologische Funktion verändert – die grundlegende Sprache der Proteinbiologie. Durch die Kombination genetischer, zellulärer, enzymatischer und biophysikalischer Methoden werden unsere Studien ein molekulares Verständnis der Rolle der Konformationsdynamik von Proteinen in der Biologie liefern, die den Stoffwechsel beim Menschen reguliert. Unsere Studien werden die funktionelle Bewertung von P450-Reduktase-Varianten in Stoffwechselprozessen etablieren und bei der Diagnose und Behandlung durch Nahrungsergänzungsmittel helfen.

Direct link to Lay Summary Last update: 18.10.2021

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Collaboration

Group / person Country
Types of collaboration
Prof. Rita Bernhardt, Saarland University, Germany Germany (Europe)
- in-depth/constructive exchanges on approaches, methods or results
- Research Infrastructure

Awards

Title Year
Best Oral Presentation: Swiss Society for Endocrinology and Diabetology 2021

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
113719 Pharmacogenomics of human P450 oxidoreductase 01.07.2007 Project funding (Div. I-III)
134926 Pathogenesis of disorders caused by human P450 oxidoreductase mutations 01.07.2012 Project funding (Div. I-III)

Abstract

BACKGROUND: Mutations in human NADPH cytochrome P450 oxidoreductase (POR) cause metabolic disorders. The work of Pandey and others has set the foundation that POR operates as a central molecular hub selectively activating CYPs and controlling metabolic cascades. Recent work has focused on which POR mutations cause aberrant CYP functions and metabolic disorders. However, we have a limited understanding of how POR mutations result in aberrant metabolism. RATIONALE: The mechanistic details of the interplay between biochemical inputs, allosterically coupled protein domains, and downstream effectors underlying POR activity and plasticity, which are crucial for pharmacology and metabolic control, remain poorly understood. The central scope of this project is to elicit a detailed understanding of the elusive role of structural dynamics on POR activity and plasticity and dissect for the first time how pathogenic mutations and regulatory inputs control POR functional phenotype; and capitalize on these insights to explore novel ligands that target POR, to control the activation of CYPs with the aim of reversing metabolic disorders. Experiments plan and aims: (1) Cell and biochemical studies: In Switzerland, we will use of CRISPR/CAS system to edit the human P450 reductase sequence in adrenal cells to create personalized models of actual human mutations for the study of steroid disorders. This will allow the measurement of enzyme activities in an ideal cell environment. In a second approach, we will create recombinant forms of POR mutants by bacterial expression and purification, and assay enzyme kinetics and interaction with CYP and other redox partners. 2. Single-molecule studies in Copenhagen: we aim to extend beyond classic assays that report the average behavior of many unsynchronized proteins often masking high-energy transient intermediates, rarely sampled states, and the stochastic nature of dynamics that may underlie function and specificity. Single-molecule functional studies allow the direct observation of individual catalytic cycles. Using enzyme kinetics, cell assays along with single-molecule studies, we will generate a conformational understanding of genetic variations in POR that cause disease or result in differences in drug and steroid metabolism.SIGNIFICANCE: Unveiling the existence of time-dependent activity fluctuation and distribution of activities between identical proteins is a phenotype that remains masked in conventional averaging kinetics. The potential of direct and synchronous observation of structural and functional dynamics of an enzyme at work promises to uncover how structural dynamics encode biological function - the fundamental language of protein biology. By combining genetic, cellular, enzymatic, and biophysical methods, our studies will provide a molecular understanding of the role of protein conformational dynamics in redox biology and electron transfer patterns that govern drug and xenobiotic metabolism in humans. Our studies will establish the functional assessment of P450 reductase variants in metabolic processes and help with diagnosis and treatment by supplements.
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