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Structural and mechanistic investigations of membrane-integral enzymes involved in eukaryotic protein N-glycosylation pathway

Applicant Locher Kaspar
Number 196862
Funding scheme Project funding
Research institution Institut für Molekularbiologie und Biophysik Deptartement für Biologie ETH Zurich
Institution of higher education ETH Zurich - ETHZ
Main discipline Biophysics
Start/End 01.01.2021 - 31.12.2023
Approved amount 825'000.00
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All Disciplines (2)

Discipline
Biophysics
Organic Chemistry

Keywords (8)

Oligosaccharyltransferase; Lipid-linked oligosaccharide synthesis; Membrane protein; Protein N-glycosylation; Cryo-EM structure determination; Glycosyltransferases; ALG enzymes; Catalytic mechanism

Lay Summary (German)

Lead
Die N-Glykosylierung beschreibt die "Dekoration" von Proteinen mit komplexen Kohlenhydraten, was für eukaryotische Zellen essentiell wichtig ist. Der Prozess beginnt im endoplasmatischen Retikulum (ER), wo zunächst Zuckereinheiten zu komplexen Glycanen zusammengesetzt und anschliessend auf Proteine übertragen werden. In diesem Projekt sollen mittels einer Kombination von synthetischer Chemie und Strukturbiologie Einblicke in die Funktionsweise der Enzyme geliefert werden, die für diese Prozesse verantwortlich sind.
Lay summary
Die N-Glykosylierung ist eine post-translationale Modifikation von sekretorischen Proteinen, die insbesondere in Eukaryoten essentiell wichtig ist. Die gebundenen Glykane haben viele und unterschiedliche physiologischeFunktionen und sind auch an Krankheitsprozessen oder zellulären Wechselwirkungen mit Krankheitserregern beteiligt. Die Protein-N-Glykosylierung beginnt im endoplasmatischen Retikulum (ER), wo ein Glykan mit hohem Mannosegehalt zunächst zusammengebaut und anschliessend auf Asparaginreste von Akzeptorproteinen übertragen wird.
In diesem Projekt werden sowohl die Biosynthese des Glycans als auch dessen Transfer auf Proteine untersucht. Mittels chemisch-synthetischer Methoden werden Trägermoleküle hergestellt, die dem zellulären Dolichol ähneln und mit deren Hilfe die beteiligten Glykoysltranferasen das erwünschte Glycan zusammenbauen. Mittels Cryo-Elektronenmikroskopie werden hochaufgelöste Strukturen bestimmt, mit deren Hilfe der Mechanismus der beteiligten Enzyme entschlüsselt werden kann. Die gleiche Methodik wird verwendet werden, um den Transfer des Glycans auf Proteine zu untersuchen. Diese Reaktion wird von einem Enzym katalysiert, das Oligosaccharyltransferase heisst. Es soll der präzise Mechanismus charakterisiert werden, der dies ermöglicht.
Die Kombination von synthetischer Chemie mit Membranproteinbiochemie und Strukturbiologie ist für diese Forschung von wesentlicher Bedeutung. Sie erleichtert die chemo-enzymatische Synthese komplexer Substrat-Analoga, die nicht kommerziell erhältlich sind und nicht in sinnvollen Mengen aus natürlichen Quellen gereinigt werden können. Angesichts der Bedeutung von N-Glykanen in therapeutischen Produkten (z. B. Antikörpern) kann die Grundlagenforschung der Maschinerie, die diese Glykane zusammensetzt und auf Akzeptorproteine überträgt, zu neuen biotechnologischen Anwendungen führen, indem verbesserte Methoden zur Herstellung eukaryotischer Glykoproteine entwickelt werden.
Direct link to Lay Summary Last update: 08.01.2021

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Project partner

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
205330 A nitrogen cooled NMR cryoprobe and a new console for the measurement of low concentrated samples 01.01.2022 R'EQUIP
189111 Structural and mechanistic studies of liver ABC transporters 01.10.2019 Project funding
178998 Chemical Space Design of Small Molecules and Peptides 01.04.2018 Project funding
185544 NCCR TransCure: From transport physiology to identification of therapeutic targets (phase III) 01.11.2018 National Centres of Competence in Research (NCCRs)
207976 Chemical Space Inspired Building Blocks and Peptides for Medicinal Chemistry 01.04.2022 Project funding

Abstract

N-linked glycosylation is a post-translational modification of secretory proteins and an essential process in eukaryotes. The attached glycans have a wide range of physiological functions and are also involved in disease processes or cellular interactions with pathogens. Protein N-glycosylation begins in the endoplasmic reticulum (ER), where a high-mannose glycan is transferred from a dolichylpyrophosphate donor to asparagine residues in acceptor proteins. This glycan is subsequently processed in the Golgi compartment, generating a vast diversity of N-glycans decorating secretory proteins.This project aims at elucidating the structural and mechanistic basis of key components of the ER-based N glycosylation machinery. On the one hand, we will focus on ALG (asparagine-linked glycosylation) proteins, a series of membrane-integral glycosyltransferases that assemble the complex glycan of the lipid-linked oligosaccharide (LLO). On the other hand, we will study the eukaryotic oligosaccharyltransferase (OST) that catalyzes the transfer step. To do so successfully requires a collaborative approach: The Locher group will contribute their expertise in structural biology and functional characterization of membrane proteins, while the Reymond group will generate synthetic analogs of the lipid-linked oligosaccharides that represent the substrates of the ALG- and OST-catalyzed reactions. This ongoing collaboration was part of a SNF-funded Sinergia project headed by Markus Aebi (ETH Zurich), a world leader in glycobiology and yeast genetics. Within the Sinergia project, key breakthroughs in understanding OST and ALG enzymes were made. These advances form the basis of the present project, where key mechanistic questions can be addressed. Aebi will continue to advise the project as a project partner, but due to his retirement in the summer of 2020 will not contribute any experimental work.The following goals will be pursued:•To understand how single-subunit (T. brucei STT3A or STT3B) and octa-subunit (e.g. yeast) OST recruit, bind to, interact with, and selectively process their lipid-linked oligosaccharide substrates, we will determine high-resolution cryo-EM structures of OST enzymes trapped in ternary complexes with chemically altered acceptor and donor substrates analogs. •To reveal the mechanistic basis of LLO biosynthesis in the ER, we will study multiple ALG enzymes using structural and biochemical approaches. To reveal their structures by cryo-EM, we will generate conformational antibody fragments (Fabs) that reduce the dynamics of the target proteins and increase particle mass for high resolution cryo-EM analysis. A key question is how the substrate specificity of the ALG enzyme series facilitates a correct processing and uniform generation of a complex glycan for OST. To address this, we will determine structures of four key ALG enzymes (ALG3, ALG6, ALG9, and ALG12) in intermediate states with donor and substrate analogs bound.The combination of synthetic chemistry with membrane protein biochemistry and structural biology is essential for this research. It facilitates the chemo-enzymatic synthesis of highly complex substrate analogs that are not commercial and cannot be purified from natural sources in meaningful amounts. As a team and with our collaborative expertise, we are thus in a unique position to address these mechanistic questions. Because N-linked glycosylation is one of the most prominent protein modifications, a detailed understanding of the initial, ER-based steps is of great biological interest. Given the importance of N-glycans in therapeutic products (e.g. antibodies), fundamental research into the machinery that assembles these glycans and transfers them to acceptor proteins may lead to new biotechnological applications by generating improved methods to produce eukaryotic glycoproteins.
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