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Microfluidic Sample Preparation for High-Resolution Electron Microscopy, Visual Proteomics and Electron Tomography

English title Microfluidic Sample Preparation for High-Resolution Electron Microscopy, Visual Proteomics and Electron Tomography
Applicant Braun Thomas
Number 192190
Funding scheme Project funding (Div. I-III)
Research institution C-CINA Biozentrum Universität Basel
Institution of higher education University of Basel - BS
Main discipline Other disciplines of Physics
Start/End 01.03.2021 - 28.02.2025
Approved amount 869'882.00
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All Disciplines (2)

Discipline
Other disciplines of Physics
Biophysics

Keywords (6)

Protein dynamics; Microfluidics; Electron microscopy; Control software; Structural biology; Biophysics

Lay Summary (German)

Lead
Die Erforschung dreidimensionaler Eiweissstrukturen ist wichtig für das Verstännis biologischer Prozesse und die Entwicklung von neuen Medikamenten. Die Kombination von miniaturiserten Methoden für die Protein- Produktion, Isolation und Probenpräperation mit der Elektronenmikroskopie eröffnet neue Perspektiven in der biomedizinischen Forschung.
Lay summary

lektronenmikroskopie hat in den letzten Jahren die Charakterisierung bioloigische Strukturen revolutioniert. Dabei müssen nur einge Tausend, bis wenige Millionen Proteinpartikelchen im Elektronenmikroskop abgebildet werden. Dannach kann durch aufwändige Computeralgorithmen die Proteinstruktur bestimmt werden. Während die mikroskopischen Verfahren und Computerprogramme sich in den letzten Jahren massiv verbessert haben, hat sich die Probenpräparation seid derenErfindiung durch Jacques Dubochet (Nobellpreis 2017) kaum verändert. Im Arbeitsablauf für die Strukturbestimmung durch Elektronenmikroskopie ist die Probenpräperation der limmitierende Schritt. Zum Beispiel gehen bei der Präparation der Proben 99.99% der Proteine verloren.

Wir entwickeln neue miniaturisierte Methoden für die Probenvorbeiretung. Diese Methoden haben gleich mehrere Vorteile gegenüber klassische Strategien: (i) Probenmengen können signifikant (Faktor 1000) vermindert werden (totales Volumen: 3-25 nL). Dies erlaubt auch biologische systeme zu studieren, die nur in gerningen Mengen produziert werden können, da das Verfahren nahezu verlustfrei arbeitet. (ii) Die Probenpräparation ist wesentlich sanfter und schneller. Beides führt dazu das empfindliche Proteinkomplexe besser erhalten bleiben. (iii) Die Isolation der Zielproteine kann direkt an die Probenpräparation gekoppelt werden. Das erlaubt die Strukturaufklärung von geringsten Mengen an Startmaterial (weniger als 1μL Zellextrakt). Insgesammt erlaubt die neue Methode das Studium von besonders empfindlichen und schwierigen Proteinkomplexen, die von biomedizinischer Bedeutung sind, aber nicht surch klassische Methoden charakterisiert werden können.

Die geringe Probenmenge erlaubt auch, ganz neuartige biologische Experimente zu entwickeln. Zum Beispiel kann die Probenpräparation direkt an einen Einzelzellpicker gekoppelt werden. Das erlaubt die visualisierung sämtlicher cytosolischen Proteine der Zelle. Zurzeit sind wir dabei, Komputeralgorithmen zu entwickeln, welche die Strukturänderungen der Protein zwischen zwei Zellen direkt misst.

Die neuen Methoden, und Verfahren die entwickelt werden, werden zum Studium neurodegenrativer Krankheiten eingesetzt. Zum Beispiel wird die Huntington Erkrankung in Kollaboration mit der Gruppe von Eline Pecho-Vriesling der Universität Basel untersucht.

Direct link to Lay Summary Last update: 03.12.2020

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Project partner

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
162521 Fast protein-complex isolation, sample preparation and data processing for high-resolution structural analysis and visual proteomics 01.02.2016 Project funding (Div. I-III)

Abstract

Electron microscopy (EM) introduced a fast and lasting change to structural and cellular biology. Direct electron detector cameras and improved image processing algorithms now allow structure determination of large biomolecules by cryogenic EM (cryo-EM) at atomic resolution using a single particle approach.Also, strategies to study the cellular ultrastructure, such as electron tomography (ET), correlative light and electron microscopy (CLEM), and the lamella milling of eukaryotic cells, opened new windows allowing biologists to study the mechanism of cellular processes at unprecedented precision. Unfortunately, sample preparation remains a bottleneck, and, surprisingly, EM is rarely used as a bioanalytical tool despite its immense potential to detect proteins on the single-molecule level. Both (i) new single-cell analysis tools and (ii) advanced methods for protein isolation and cryo-EM sample preparation are urgently needed. Here, we aim at (i) the development of a versatile system for the fast protein production, protein isolation, and cryo-EM sample preparation for the structural analysis of sensitive protein complexes, (ii) the development of a new targeted and untargeted single-cell analysis method named 'single-cell visual proteomics,' and (iii) the development of a new strategy for the blotting-free cryopreservation of eukaryotic cells to study cellular structures by ET.
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