Project

Discipline

neuronal morphology; myelination; cell adhesion molecule

Lead
Analyse der Funktion der konstanten Region von Antikörpern in Neuronen
Lay summary
Antikörper (Immunglobuline) werden von Plasmazellen des Immunsystems gebildet. Immunglobuline sind Teil der körpereigenen Abwehrreaktion gegen Schädlinge wie Viren oder Bakterien, welche in den Körper eingedrungen sind. Antikörper werden von verschiedenen Genabschnitten codiert. V, D und J Abschnitte codieren die variable, Antigen erkennende Region der Immunglobuline und die Fc-Abschnitte bilden die konstanten Regionen. In unseren Untersuchungen haben wir den überraschenden Befund gemacht, dass zwei verschiedene Fc-Abschnitte nicht nur von Zellen des Immunsystems exprimiert werden, sondern auch von verschiedenen Neuronen des zentralen Nervensystems (ZNS) der Maus. Die Funktion, welche die Fc-Abschnitte im Nervensystem ausüben könnten, ist vollkommen ungeklärt. Innerhalb des Projekts, welches durch diesen Spark-Grant gefördert wird, werden wir der Frage nach der Funktion der Fc-Abschnitte in Neuronen nachgehen. Dazu werden wir zwei experimentelle Strategien verwenden; 1. Wir werden die Fc-Abschnitte in Neuronen des Maus überexprimieren. Das heisst wir führen experimentell den Zustand herbei, dass entweder mehr Fc-Abschnitte in Neuronen gemacht werden oder Fc-Abschnitte in Neuronen gemacht werden, welche normalerweise keine Fc-Abschnitte produzieren. Wir werden dann untersuchen, ob die Überexpression einen Einfluss auf die Morphologie (Form) und Funktion der Neurone hat. 2. Wir werden die Fc-Abschnitte ausschalten. Das heisst, wir führen experimentell den Zustand herbei, dass keine Fc-Abschnitte mehr produziert werden können. Wir werden dann untersuchen, ob das Ausschalten einen Einfluss auf die Morphologie und Funktion der Neurone hat. Einige wissenschaftliche Berichte deuten darauf hin, dass Antikörper eine Rolle bei der Myelinisierung von Nervenzellen oder aber auch eine Rolle in Neurodegenerativen Prozessen spielen könnten. Die Kombination der hier kurz dargelegten Strategien wird uns erlauben eine Idee davon zu bekommen, ob in Neuronen produzierten Fc-Abschnitte ebenfalls eine Rolle in diesen Prozessen spielen.

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Last update: 07.01.2020

We have used Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) on two BAC-TRAP transgenic mouse lines to develop an unbiased classification of spinal cord interneurons. Among the most highly enriched genes expressed in inhibitory spinal neurons, we found a transcript that codes for the constant region of the immunoglobulin heavy chain IgG3 (gene Ighg3), which is generally thought to be exclusively expressed in B cells. In situ hybridization demonstrated that Ighg3 was expressed in a small number of GABAergic neurons strategically localized at the border between dorsal horn lamina II and III. Further experiments revealed a second heavy chain gene (Ighm encoding the constant region of IgM) that was more widely expressed in the CNS but again at very well-circumscribed sites, such as layers 5-6 of the cerebral cortex. A non-neural origin (i.e., from lymphocytes) could be ruled out because both transcripts were retained in Rag1-deficient mice that lack B and T lymphocytes. Further analyses of the transcripts demonstrated that variable immunoglobulin regions (V, D or J elements) were not expressed suggesting that neurons only express the constant regions of IgG3 or IgM. Well-established functions of these constant regions include macrophage/microglia recruitment and activation of the complement system. In the CNS, microglia activation and the complement system play important roles in synaptic pruning, neuronal development and several CNS pathologies. In addition, a whole family of immunoglobulin-like proteins exists that function as cell adhesion molecules and are key elements of neuronal path-finding and synapse formation. Many lines of evidence support that alterations in these processes contribute to a variety of diseases ranging from neurodevelopmental disorders (autism and schizophrenia) and neurodegenerative diseases (Alzheimer’s disease and multiple sclerosis) to chronic neuropathic pain. In the present application, I propose to identify the full length transcript(s) and to investigate whether the identified transcripts are translated into proteins (aim 1), define their subcellular localization in neurons of the mouse CNS (aim 2), and examine potential effects of Ighg3 and Ighm deletion on dendritic and axonic arborization and synaptic morphology (aim 3). For aims 1 and 2, I will employ CRISPR/Cas9 technology to express C-terminus fluorescent protein-tagged IgG3 and IgM heavy chains at restricted cortical and spinal cord sites. For aim 3, I will use the same technology to produce local knock-outs of Ighg3 and Ighm that express a fluorescent protein in the cytoplasm of the targeted neurons allowing a detailed analysis of their morphology. Experiments will focus on two CNS sites, where Ighm or Ighg3 are expressed in well-defined neuron populations, namely the cerebral cortex and the spinal cord. CRISPR/Cas9-mediated mutations will be introduced using embryonic or postnatal Rosa26Cas9 mice into which small guide RNAs (sgRNAs) will be introduced with in utero electroporation (cerebral cortex) or local injection of rAAV (spinal cord). Sections of the cerebral cortex and spinal cord of these mice will be taken at different stages of development and expression of the fluorescently tagged heavy chains will be analyzed with confocal microscopy and light-sheet microscopy in cleared whole brain or spinal cords.