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XenoImport - Towards a generic synthetic import system for Escherichia coli

English title XenoImport - Towards a generic synthetic import system for Escherichia coli
Applicant Panke Sven
Number 179521
Funding scheme Project funding (Div. I-III)
Research institution Computational Systems Biology Department of Biosystems, D-BSSE ETH Zürich
Institution of higher education ETH Zurich - ETHZ
Main discipline Experimental Microbiology
Start/End 01.08.2018 - 31.07.2022
Approved amount 957'692.00
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Keywords (6)

Gamma-glutamyl transferase; Sulfonate import; Outer membrane; Synthetic substrate uptake; Metabolic engineering; Xenobiology

Lay Summary (German)

Lead
Bakterien sind unter den wichtigsten Produktionsorganismen für Chemikalien und Pharmazeutika in der Biotechnologie. Ihre Identität und ihre Kommunikation mit und Versorgung aus der Umgebung werden durch die Zellhülle gewährleistet, die bei einem grossen Teil der Bakterien, den Gram-negativen, aus 2 selektiven Membranen besteht. Diese selektiven Barrieren müssen für viele Anwendungen der Bakterien in der Biotechnologie überwunden werden, und dieses Projekt versucht, einen generell anwendbaren Weg dafür zu implementieren.
Lay summary
Inhalte und Ziele des Forschungsprojekts

Wichtige Forschungsbereiche in der Biotechnologie sind davon abhängig, dass man Verbindungen von aussen über eine Zellmembran bringen kann - zB wenn man einen neuen Syntheseweg mit mehreren Schritten entwickeln und man an der Umsetzung der verschiedenen Zwischenstufen arbeiten will, bevor man de Zwischenstufe in der Zelle selbst herstellen kann. Da diese Membranen selektiv sind, ist die Anzahl an Verbindungen, die man einfach so in die Zelle einführen kann, begrenzt. Gram-negative Bakterien haben zwei Membranen. Die äussere kann durch nicht-selektive Poren passiert werden, die ein Limit für die Grösse des Moleküls bedeuten, das eingeschleust werden soll (Hindernis 1). Die innere Membran muss dann mit Hilfe selektiver Transportproteine passiert werden, und diese Selektivität ist Hindernis 2.

In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass  man Hindernis 2 umgehen kann, indem man an die Zielverbindung, die man gern in der Zelle hätte, eine Sulfonatgruppe anhängt. Sulfonattransporter weisen nur eine geringe Selektivität auf. So bekommt man chemische Moleküle recht zuverlässig in die Zelle, aber man muss dort dann die Sulfonatgruppe wieder entfernen - Hindernis 3 auf dem Weg in eine Bakterienzelle. Das Entfernen kann man durch eine Variante eines Enzyms namens gamma-Glutamyltransferase erreichen.

Hier wollen wir die Methoden etablieren, die es uns erlauben, alle drei Hindernisse zu überwinden. Dabei verwenden wir "gerichtete Evolution", um Proteinfunktionen (Poren, Transporter, Enzyme) durch das Wechselspiel von Mutation und Selektion auf ein vorgegebenes Ziel hin zu verändern. Dazu müssen wir in vivo (in Zellen) und in vitro (zellfrei) Methoden aufstellen, mit denen wir im Hochdurchsatz veränderte Proteine auf neue Funktionen testen können.

Wissenschaftlicher und gesellschaftlicher Kontext des Forshcungsprojekts
Dieses Projekt hat eine starke angewandte Komponente, da die Verfahren und Proteine, die wir hier entwickeln, für eine Reihe von Entwicklungen in der produzierenden Biotechnologie wichtig sein werden. Es sollte in der Zukunft dann sehr viel einfacher und schneller möglich sein, neue Stoffwechselwege zu konstruieren.
Es gibt aber auch eine fundamentale Komponente. Zur Zeit gibt es vielfältige Anstrengungen, die Biochemie des Lebens zu erweitern - neue Aminosäuren in Proteine einzubauen, neue Vitamine für neue Enzyme bereitzustellen, oder sogar neue genetische Polymere (eine Alternative zur DNS) zu entwickeln. Alle diese Moleküle müssen zuerst das Innere eines Bakteriums erreichen - und wir glauben, dass das durch dieses Projekt sehr viel einfacher werden wird.
Direct link to Lay Summary Last update: 03.04.2018

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Abstract

The two layers of the cellular envelope of a gram-negative bacterium such as Escherichia coli control the chemical traffic into a cell. They present a challenge for a variety of fundamental interrogations of biological mechanisms and manipulations to program cells as they limit the set of molecules that can be reliably delivered to the cytoplasm. Here, we propose a strategy with broad scope to overcome this barrier. It relies on portage transport of chemical cargoes by attaching them to the vector sulfobutanic acid and then using the highly promiscuous Ssu transport system of the cytoplasmic membrane for import. In the cytoplasm, the cargo is unloaded through the activity of a ?-glutamyl transferase, which naturally displays high substrate promiscuity as well. We have established in previous work the foundations for this synthetic import system in terms of selecting the import system for traffic across the cytoplasmic membrane, of re-directing the location of the ?-glutamyl transferase from the periplasm into the cytoplasm, and of re-engineering its substrate specificity to accept substituted sulfobutanoic acid instead of glutamate. We are proposing now to develop a set of three assays that together allow a systematic functional analysis and engineering of each of the three critical steps of the passage across the envelope: diffusion through an outer membrane pore, active import by the Ssu system, and unloading by ? glutamyl transferase. Specifically, we will develop assays that allow confirming and engineering the activity of ?-glutamyl transferase in vitro and two in vivo assays that rely on the release of the vector sulfonate in either the periplasm or the cytoplasm as a carbon and sulfur source. With each of the steps available for engineering by screening or selection, we can establish a systematic workflow that will allow us to extend the chemical scope of the synthetic import system beyond the current - already very auspicious - state. For the in vitro assay, we will apply and develop microfluidic strategies to analyze large populations of ?-glutamyl transferase variants with the ultimate goal of providing reliable intracellular access of biotinylated ribonucleosides and SNAP-tag substrates, expanding the realm of in vivo chemical biology. For the in vivo assays we will optimize the metabolic exploitation of the chemical vector, sulfobutanoic acid, as a substrate and then exploit this for the engineering of the monomeric ß-barrel outer membrane protein FhuA. This can be converted from a component in the bacterial uptake of ferric hydroxamate to a non-discriminating passive outer membrane pore of particular large diameter by removing its so-called “cork-domain”. By exploring the effects of a systematic shortening of extracellular loops, recombination of ß-strands, and error prone PCR we will attempt to select for FhuA variants that allow passage for compounds with a molecular weight larger than 600. Finally, we will construct and thoroughly optimize an operon that controls the expression of all the protein players of the synthetic import system and use it to select for improvement of the import across the cytoplasmic membrane of charged non-canonical amino acids and substrates for reengineering nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) metabolism, to ultimately support controlled protein phosphorylation and the introduction of novel redox pairs into biochemistry. The three proposed assays represent a toolbox that allows systematic engineering of cellular import. We think that they will become highly useful in the efforts of synthetic biology to fundamentally re-organize the chemical workings of bacterial cells.
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