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GlycoSTART: Structure and function of eukaryotic oligosaccharyltransferase

Applicant Locher Kaspar
Number 173709
Funding scheme Sinergia
Research institution Institut für Mikrobiologie Departement Biologie ETH Zürich
Institution of higher education ETH Zurich - ETHZ
Main discipline Interdisciplinary
Start/End 01.06.2017 - 31.12.2020
Approved amount 1'450'836.00
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All Disciplines (5)

Discipline
Interdisciplinary
Molecular Biology
Organic Chemistry
Biochemistry
Genetics

Keywords (6)

Röntgenkristallographie; Protein N-Glykosylierung; Quantitative Glycoproteomics; Oligosaccharyltransferase; Single particle cryoEM; Hefe Genetik

Lay Summary (German)

Lead
Die N-gebundene Glykosylierung von Proteinen ist eine der häufigsten Modifikationen von Proteinen in eukaryotischen Zellen. Die zentrale Reaktion in diesem äusserst komplexen Prozess ist Übertragung eines Oligosaccharids von einem Lipid auf die Asparagin-Seitenkette von Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum. Diese Reaktion wird vom Enzym Oligosaccharyltransferase katalysiert. Ziel des vorliegenden Projekts ist die Aufklärung der molekularen dreidimensionalen Struktur dieses Enzyms und die Untersuchung des zugrundeliegenden Reaktionsmechanismus.
Lay summary
Die Oligosaccharyltransferase in eukaryotischen Zellen ist ein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums verankertes Enzym. In einfachen, einzelligen Organismen wie z.B. Trypanosomen, liegt es in einer einfachen Form, bestehend aus einer Polypeptidkette vor. In mehrzelligen Organismen (Pilze, Pflanzen oder Tiere) besteht das Enzym aus mehreren Untereinheiten. 
GlycoStart hat sich zum Ziel gesetzt, die Funktion und den molekularen Aufbau der einfachen Oligosaccharyltransferase von Trypanosomen und des komplexen, aus 8 Untereinheiten bestehenden Enzyms der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufzuklären. Zu diesem Zweck werden die entsprechenden Enzyme mit Hilfe biochemischer Methoden gereinigt und ihre Eigenschaften mit Hilfe biochemischer Methoden charakterisiert. Dazu müssen mittels chemischer Synthese die Substrate (Lipid-gebundene Oligosaccharide und Peptide) chemisch hergestellt werden. Die gereinigten Enzyme werden ausserdem dazu verwendet, um mittels Röntgenstrukturkristallographie und Cryo-Elektronenmikroskopie die molekulare Struktur der Oligosaccharyltransferasen zu ermitteln. Strukturelle und biochemische Daten sind die Grundlage für die funktionelle Analyse. Zu diesem Zweck werden mittels reverser Genetik Enzyme mit veränderter Aminosäuresequenz im Modellorganismus S. cerevisae hergestellt und die Auswirkung dieser Mutationen auf den Prozess der N-Glykosylierung von Proteinen getestet. Für diese Analyse gelangen quantitative Methoden der Massenspektrometrie zum Einsatz.
Durch die Kombination von chemischen, strukturbiologischen und molekulargenetischen Methoden wird die Funktionsweise des zentralen Enzyms im Prozess der N-Glykosylierung von Proteinen ermittelt. Diese Proteinmodifiaktion ist für alle eukaryotischen Lebensformen essentiell, ist aber auch für die Herstellung von rekombinanten Protein, wie z.B. therapeutische Antikörper, von entscheidender Bedeutung.
Direct link to Lay Summary Last update: 02.06.2017

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Publications

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
147632 Transglyco: Chemistry, Enzymology and Physiology of Oligosaccharyltransferase 01.11.2013 Sinergia
189111 Structural and mechanistic studies of liver ABC transporters 01.10.2019 Project funding (Div. I-III)
160620 NCCR TransCure: From transport physiology to identification of therapeutic targets (phase II) 01.11.2014 National Centres of Competence in Research (NCCRs)
182835 N-linked protein glycosylation 01.11.2018 Project funding (Div. I-III)
162636 N-linked protein glycosylation: generating diversity 01.11.2015 Project funding (Div. I-III)
166672 Structural and mechanistic studies of components of bacterial protein N-glycosylation pathway and of vitamin B12 transport 01.04.2016 Project funding (Div. I-III)
155982 Controlling multi-antibiotic resistant bacteria with antimicrobial peptide dendrimers (AMPD) 01.10.2015 China

Abstract

N-linked protein glycosylation is the most frequent and the most diverse post-translation modification in eukaryotic cells. Two dedicated organelles, the Endoplasmic Reticulum (ER) and the Golgi contain the synthetic machinery that generates this diversity. The process is essential and initiates in the ER, where the Glc3Man9GlcNAc2 oligosaccharide is assembled onto a lipid carrier, dolichylpyrophosphate. This unique oligosaccharide is efficiently transferred to selected N-X-S/T sequons of polypeptides that enter the ER lumen. This is crucial to ensure the function of the covalently linked glycans in the subsequent folding and quality control of N-glycoproteins. In contrast to the precise and highly conserved ER pathway, the subsequent trimming and remodeling of N-linked glycans in the Golgi follows a completely different regime and generates a heterogeneous, but defined assembly of N-glycans in a species-, cell-, protein- and site specific manner.The GlycoSTART proposal focuses on the initiating step of N-glycosylation, catalyzed by oligosaccharyltransferase (OST). Based on the successful track record of our collaborative efforts that addressed the structure and function of the bacterial OST PglB, we now aim at understanding the molecular basis of eukaryotic OST which ranges from a single subunit enzyme (ssOST) in kinetoplastids to multimeric complexes such as the octameric OST (octOST) in Saccharomyces cerevisiae. The increase in enzyme complexity during eukaryotic evolution correlates with an increased number of sites modified by the enzyme in the corresponding organisms, suggesting a fundamental role of auxiliary OST subunits in polypeptide substrate recognition. We will purify recombinant ssOST and octOST to homogeneity and will determine their high resolution structures using a combination of X-ray crystallography and single particle cryo-electron microscopy. To study the biochemical properties of these enzymes, we take advantage of the enabling technology of synthetic chemistry: the synthesis of complex lipid-linked oligosaccharide substrates (LLO), peptide acceptor sequences, and inhibitory substrate analogs will fill a gap that has for a long time slowed down functional studies of eukaryotic OST. In particular, a combination of chemical synthesis and enzymatic extension using defined mannosyltransferases will be applied to achieve complex substrates such as the Man5GlcNAc2-LLO. The biochemical analysis of OST function will support and complement the structure determination and a mechanistic understanding of the OST enzymes. The combination of structural and biochemical studies will make it possible to formulate hypotheses regarding functional OST properties. We will test these functionalities in vivo using the unique properties of the yeast system that allows precise genetic alterations of the OST enzymes and both the LLO and peptide substrates. Quantitative, MS-based glycoprotemics methods will be used to describe OST activity. Kinetic in vivo analysis will make it possible to integrate the reaction that starts N-glycosylation into the complex ensemble of N-glycoprotein biogenesis pathways. N-glycoproteins are widely produced for medical and other applications. Our previous results on the bacterial N-glycosylation process and on the functional and structural characterization of the bacterial OST had a profound impact on the application of the bacterial N-glycosylation system for the biotechnological production of glycoconjugate vaccines. We anticipate a similar effect of our studies on the manufacturing of eukaryotic glycoproteins.
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