Project

Discipline

RB-RELATED PLANT PROTEINS; PLANT RETINOBLASTOMA; FUNCTIONAL ANALYSIS; PROTEOMICS; ARABIDOPSIS MODEL SYSTEM; CHROMATIN

Lead
Das Retinoblastoma Protein (Rb) wurde vor etwa 25 Jahren als Tumorinhibitor erkannt da Mutationen im Rb Gen verschiedene Krebskrankheiten auslösen. Seitdem wurden verschiedene Funktionen des RB Proteins aufgeklärt. Am wichtigsten ist die Funktion des Rb Proteins in der Regulation der Zellteilung die auch seine Eigenschaft als Tumorinhibitor erklärt. Allerdings steuert das Rb Protein auch eine Reihe von anderen zentralen Vorgängen, wie zum Beispiel Entwicklungs- und Zelldifferenzierung. Dabei interagiert das Rb Protein mit einer Anzahl von anderen regulatorischen Proteinen. In vielen Fällen ist die biologische Funktion dieser Interaktionen noch unbekannt. Insbesondere sind die zeitlichen Abläufe der Interaktionen ungeklärt. Das Rb Gen ist in Pflanzen konserviert und die post-embryonale Entwicklung von Pflanzen erlaubt es, die zeitlichen Abläufe von Interaktionen zwischen Rb und anderen regulatorischen Proteinen aufzuklären.
Lay summary
Das Retinoblastoma-ähnliche Protein (RBR) in der Modellpflanze Arabidopsis interagiert genetisch und biochemisch mit regulatorischen Proteinkomplexen, die an Steuerung von Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen beteiligt sind. Die Zusammensetzung und Dynamik der Proteinkomplexe während der Pflanzen- und auch Tierentwicklung sind noch weitgehend unbekannt. Im Gegensatz zu Tieren ist das RBR Protein in Pflanzen essentiell denn der Verlust des Proteins verhindert bereits die Ausbildung von Fortpflanzungszellen. Daher erfordert die Untersuchung der Dynamik von Proteinkomplexen ein induzierbares System mit dem das RBR Protein vor oder während Entwicklungs- und Differenzierungsvorgängen über einen bestimmten Zeitraum aus der Zelle entfernt werden kann. Wenn nun das RBR Protein mit einer Markierung versehen ist die es erlaubt das Protein mit Hilfe von Antikörpern oder einer Affinitätsmatrix anzureichern, ist es möglich die Dynamik der Komplexe, die das RBR Protein mit verschiedenen regulatorischen Proteinen eingeht, zu untersuchen. Dabei wird angenommen, das die Zusammensetzung und Interaktionsdauer von RBR Proteinkomplexen unterschiedlich und auch spezifisch ist, was Rückschlüsse auf die Dynamik der regulatorischen Vorgänge erlaubt. Dabei ist es wichtig dass viele der Proteinkomplexe mit denen Rb in Tieren interagiert auch in Pflanzen vorkommen. Daher wird die Untersuchung der Zusammensetzung und Dynamik dieser Interaktionen zwischen RBR und den regulatorischen Proteinkomplexen in Pflanzen auch wichtige Rückschlüsse auf ähnliche Vorgänge in Tieren erlauben und somit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Tumorinhibitor Funktion des Rb Proteins im Menschen ermöglichen.

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Last update: 30.03.2014

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Background and working hypothesisThe proteins encoded by the Retinoblastoma genes in animals (pRb) and plants (RBR) are key regula-tors and the focus of intensive research because of the roles of pRb in tumor formation and RBR in plant reproduction and development. The proteins regulate cell cycle progression by interaction with the E2F/DP transcription factors, control transcription during developmental transitions via chromatin modifiers, and promote differentiation by interaction with transcription factors required for cell fate decisions. Compared to the large number of identified binary interactions between Retinoblastoma proteins and different binding partners, however, much less is known about the composition, modifications and dynamics of multi-subunit complexes that have been reported to interact with pRb and RBR. We will test our hypothesis that in Arabidopsis RBR associates with multiple complexes, both in mature tissues that have exited cell division and during key transitions (heterotrophic to autotrophic growth, vegetative to reproductive growth) during plant development.Specific aimsWe propose a detailed analysis of RBR-containing protein complexes in Arabidopsis and their persistence during loss of RBR function. We will quantitatively analyze RBR-associated complexes in ma-ture plants to gain insights into their complexity and establish a compendium of all proteins that can be assigned to individual or multiple complexes. We will then investigate selected complexes that contain or are associated with RBR for their dynamics and persistence in proliferating tissues, at developmental transitions and during ES-induced RBR depletion.Experimental designA key tool for our experimental approach will be Arabidopsis plant lines expressing tandem affinity purification (TAP)-tagged RBR as well as known and candidate interacting proteins. We have estab-lished a GATEWAY compatible cloning platform for rapid construction of N- and C-terminal TAP-tag fusion proteins expressed under the control of a choice of promoter sequences. Pyramided lines expressing differently tagged RBR and candidate interacting proteins will be used to purify complex-es from the same plant material or the same complex with different tags for reciprocal validation. Complex subunit composition and potential modifications (phosphorylation, acetylation, ubiquityla-tion) will be analyzed using quantitative and SRM mass spectrometry. Expected valueUnderstanding the complexity and dynamics of RBR function via interactions with other proteins and complexes (i.e., the RBR complexome) during the cell cycle and developmental transitions will con-tribute to answering one of the most significant outstanding questions in the Retinoblastoma re-search field. Because many of the pRb-associated complexes are conserved in plants, Arabidopsis is a well-characterized and biochemically tractable model system to unravel the RBR complexome during post-embryogenic development. We expect that together with other available data, the new quantitative information and compendium of proteins involved in the Arabidopsis RBR complexome will provide an important impetus for further research on this key regulatory protein and its associated complexes, both in plant and animals.