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Investigating developmental role of extracellular vesicles using a novel synthetic tool

English title Investigating developmental role of extracellular vesicles using a novel synthetic tool
Applicant Matsuda Shinya
Number 190607
Funding scheme Spark
Research institution Biozentrum Universität Basel
Institution of higher education University of Basel - BS
Main discipline Embryology, Developmental Biology
Start/End 01.02.2020 - 31.01.2021
Approved amount 99'951.00
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Keywords (6)

morphotrap; Exosome; protein binder; nanobody; Extracellular vesicles; ectosome

Lay Summary (German)

Lead
Extrazelluläre Vesikel (EV) sind Vesikel im Nanogrössenbereich, welche von einer grossen Vielfalt an Zellen produziert werden und Nukleinsäuren, Proteine und Lipide innerhalb oder ausserhalb des Vesikels transportieren. Es wird vermutet, dass EV Vermittler der interzellulären Kommunikation während der Entwicklung und bei Krankheiten sind. Injektionen von aus Zellkulturen gewonnen EV sowie das Ausschalten wichtiger Faktoren der EV Biogenese ergab eine Vielzahl möglicher Rollen für EV. Die physiologische Relevanz der EV bleibt jedoch, grösstenteils durch den Mangel an Methoden welche es ermöglichen EV spezifisch zu manipulieren, umstritten.
Lay summary

Erst vor kurzem wurden synthetische Methoden, basierend auf kleinen, hoch affinen Proteinbindern, im Feld der Entwicklungsbiologie angewandt um Zielproteine direkt im Lebewesen zu manipulieren. Durch die Fusion solch eines Proteinbinders mit einer funktionalen Proteindomäne und deren Expression während der Entwicklung, kann ein Protein von Interesse bewusst manipuliert werden. Eine dieser synthetischen Methoden, ein GFP Nanobody, gebunden an die transmembrane Domäne von CD8 (Morphotrap), war in der Lage in Drosophila GFP-gebundene, extrazelluläre Moleküle auf der Zelloberfläche zu binden. Meine Idee war, dass es möglich sein sollte auch EV zu binden, wenn man GFP in die extrazelluläre Domäne eines Proteins der Plasmamembran von EV einbaut. Um diese Idee zu testen, wurde GFP mit der extrazellulären Domäne eines bekannten EV Markers, CD63, gekoppelt. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass die Morphotrap es ermöglicht EV effizient zu binden und deren Ausbreitung in der Drosophila wing disc zu blockieren. Mit Hilfe dieser Methode plane ich, die Rolle der EV während der Entwicklung im Zebrafisch und in Drosophila, zu erforschen.

Spezifische Ziele

Mit Hilfe der Morphotrap testen ob EV als Morphogen Transporter fungieren

Faktoren finden welche in Drosophila wichtig sind für die Abgabe und Aufnahme von EV

EV mit Hilfe der Morphotrap in Zebrafischen binden

Momentane Vorgehen um die Rolle EV zu studieren basieren auf Mutationen in Genen, welche für die Biogenese der EV entscheidend sind. Dies kann allerdings auch viele andere zelluläre Funktionen unabhängig von EV beeinflussen. Aus diesem Grund ist die direkte Manipulation durch Morphotrap ideal um die Rolle der EV zu studieren. Dadurch können wir neue Erkenntnisse darüber gewinnen wie EV von Zellen Abgegeben und Aufgenommen werden und wie dies die Kommunikation zwischen Zellen während der Entwicklung ermöglicht. Neben der Entwicklungsbiologie sind EV in Krankheiten wie Krebs involviert. Zudem wurden EV abgewandelt um therapeutische Frachten gegen Krankheiten zu transportieren. Dadurch könnte die neue synthetische Methode, welche hier vorgestellt wurde, auch direkten Einfluss auf die Biomedizin haben.

 
Direct link to Lay Summary Last update: 20.01.2020

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Abstract

Cell-cell communication in developing organs is critical to acquire proper cell fate and organ size. It is therefore not surprising that defects in such communications cause birth defects or disease such as cancer. Despite its importance, it remains largely unknown how cells communicate with each other to build our functional organs.Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized vesicles released by a wide variety of cells that carry nucleic acids, proteins, and lipids inside or outside the vesicles, and EVs are thought to mediate cell-cell communications during development and disease. Injections of purified EVs from cell cultures and knocking down of trafficking factors critical for EVs biogenesis has begun to propose diverse roles of EVs. However, physiological relevance of EVs remains debaded mainly due to lack of tools to specifically manipulate EVs (such as production, secretion, uptake etc). Recently, synthetic tools based on small, high affinity protein binders have been applied in the field of developmental biology to directly manipulate target proteins in vivo. By fusing such protein binders to functional protein domains and expressing these fusion proteins during development, the functions of a protein of interest (POI) can be manipulated in a predictable manner. Among these synthetic tools, a GFP nanobody fused to the transmembrane domain of CD8 such that the nanobody is exposed to the outside of the cell (called morphotrap) has been shown to efficiently trap GFP-tagged extracellular molecules on the cell surface in Drosophila. I reasoned that the morphotrap can also trap EVs if GFP is inserted into the extracellular domain of a protein spanning the plasma membrane of EVs. To test this possibility, GFP was inseted in the extracellular domain of a well known EVs marker CD63, which is a member of tetraspanin family. My preliminary results so far showed that morphotrap effectively traps EVs and blocks dispersal of EVs in Drosophila wing disc (unpublished data). Using this setup, I would like to explore the developmental role of EVs using Drosophila and Zebrafish. Specific goalsTesting if EVs act as morphogen carriers by morphotrap in Drosophila Screening factors required for secretion and uptake of EVs in DrosophilaTrapping EVs by morphotrap in ZebrafishThe current approaches to study the role of EVs based on loss of genes implicated in biogenesis of EVs also affect cellular function and a variety of signalling independent of EVs formation. Therefore, direct manipulation of EVs using morphotrap without affecting general cellular functions would be an ideal means to study the role of EVs, and should provide a new insight into how EVs are secreted and uptaken by target cells to control cell-cell communication during development. Beyond developmental biology, given that EVs have been implicated in variety of diesease such as cancer, and EVs has been engineered to deliver therapeutic cargos to fight against disease, the new synthetic approach proposed here should give a direct impact to the biomedical field as well.
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