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RNA helicases in Staphylococcus aureus - from phenotypes to mechanism

English title RNA helicases in Staphylococcus aureus - from phenotypes to mechanism
Applicant Linder Patrick
Number 188736
Funding scheme Project funding (Div. I-III)
Research institution Dépt Microbiologie et Médecine Moléculaire Faculté de Médecine Université de Genève
Institution of higher education University of Geneva - GE
Main discipline Medical Microbiology
Start/End 01.10.2019 - 30.09.2020
Approved amount 184'469.00
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All Disciplines (2)

Discipline
Medical Microbiology
Molecular Biology

Keywords (5)

RNA helicase; Staphylococcus aureus; translation initiation; RNA stability; RNase

Lay Summary (French)

Lead
RNA helicases in Staphylococcus aureus - from phenotypes to mechanism
Lay summary

La bactérie Staphylococcus aureus, aussi connue comme Staphylocoque doré, est présente dans les narines de 20 à 30% de la population sans causer des problèmes. Cependant dans certains cas, cette bactérie opportuniste peut être la source de problèmes qui vont d‘infections cutanées comme des furoncles, jusqu’à des infections systémiques et graves, comme les ostéomyélites, endocardites, chocs toxiques ou sepsis. Pour survivre en compétition avec d’autres bactéries dans les narines ou lors d’une infection, la bactérie doit adapter l’expression de facteurs de virulence. Dégrader des ARNs pour changer l’expression ou réguler la traduction des ARN messagers, ARNm, sont des mécanismes qui sont rapidement suivit d’effets.

Notre laboratoire étudie depuis de nombreuses années des hélicases à ARN de la famille à boîte DEAD, nommée selon un motif d’acides aminés présents dans les protéines de cette famille. Nous avons pu démontrer que l’hélicase CshA est impliquée dans la dégradation de l’ARN, en faisant partie d’une machinerie qu’on appelle chez les bactéries le dégradosome. En utilisation des cribles génétiques, le séquençage de l’ARN, et la génétique moléculaire, nous avons montré qu’en absence de cette hélicase, l’ARNm de la pyruvate déshydrogénase est stabilisé ce qui entraine un déséquilibre d’acides gras dans la membrane. Nous sommes actuellement en train d’analyser cet effet plus en détail.

L’autre hélicase à ARN de la famille à boîte DEAD est CshB. En absence de CshB l’ARNm d’une protéine, MpfA, impliquée dans l’export du magnésium, est surabondant, ce qui entraine une croissance réduite à basse température. En utilisant des cribles génétiques nous avons pu identifier deux protéines impliquées dans l’export du magnésium, et trois protéines impliquées dans l’import du magnésium. Au jour d’aujourd’hui nous ne connaissons cependant pas les détails mécanistiques qui sont responsables de la surabondance de cet ARNm codant pour MpfA. Notre projet porte sur une caractérisation détaillée de la fonction de CshB dans le métabolisme de cet ARNm et des ARN de S. aureus en générale et de détecter des cibles directes de CshB et CshA.

Direct link to Lay Summary Last update: 09.10.2019

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
170207 RNA metabolism in virulence expression in Staphylococcus aureus 01.10.2016 Project funding (Div. I-III)

Abstract

Bacteria encounter various environments and need to be able to adapt rapidly to changing growth conditions. We study gene expression in the opportunistic pathogen Staphylococcus aureus. This bacterium peacefully colonizes the nares of 20-30% of the population in competition with other bacteria, but can also cause diseases from relatively harmless skin infections to life threatening conditions such as endocarditis, osteomyelitis or sepsis. In addition to the problem of antibiotic resistant strains, S. aureus can hide in biofilms and intracellularly, making the treatment difficult and leading to recurrent infections.Rapid changes in gene expression can be obtained by posttranscriptional regulation on the level of translation initiation, RNA processing, or RNA degradation. For many years we have been studying RNA helicases of the DEAD-box protein family. These ATP-dependent RNA binding and RNA-dependent ATP hydrolyzing proteins unwind locally double stranded RNAs and thereby contribute in bacteria to translation initiation, ribosome biogenesis, and RNA turnover. In the past we have shown that the S. aureus RNA helicase CshA is involved in RNA turnover. In recent years we have exploited the cold sensitive growth phenotype of a ?cshA mutant to identify target RNAs by a genetic suppressor screen. Analyzing 82 suppressor mutants we have found that a majority of the hit genes are involved in fatty acid synthesis and lipid biogenesis. Using mutant analysis, RNA sequencing, Northern blotting, and fatty acid measurements, combined with genetic interactions, we could show that reduced turnover of the pdh mRNA (encoding the pyruvate dehydrogenase) leads to an inability of the mutant strain to increase branched fatty acid synthesis when shifted to lower temperatures. This is likely to lead to decreased fluidity of the membrane. Here we propose to identify the directly interacting RNases and the reasons that some, but not all, RNAs require the CshA helicase for degradation. For this we will use cshA mutants, copurification of proteins in RNase deletion strains, biochemical analysis of these helicase mutant proteins, and CRAC analysis for identifying direct targets.In the case of CshB, we have recently published work where we showed that the deletion of this RNA helicase gene results in upregulation of MpfA, a putative magnesium ion transporter. We were recomforted in our interpretation by the isolation of mpfA null mutants, reducing Mg2+ export, or CorA2 missense mutations, presumably facilitating import of this ion. In subsequent screens we have isolated and analyzed other Mg2+ transporter genes and tested our hypotheses by using a magnesium sensitive riboswitch. Here we aim at understanding the molecular function of CshB with a focus in the control of expression of mpfA. For this we will perform ribosome subunit analysis and polysome profiling to test a role ribosome biogenesis or translation initiation, RNA decay analysis at low temperature, and CRAC analysis to identify direct RNA targets.The present proposal will be my last request to Swiss National Research Foundation after 32 years of funding (since 1987). Although there remains a lot to find out about bacterial DEAD-box proteins, we will concentrate here to understand the molecular targets of CshA and CshB that we identified in the last two grant periods. We hope to end our work by identifying the context and the targets of the two RNA helicases that lead to the cold sensitive growth phenotype when inactivated.
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