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Development of native-SAD phasing for membrane protein structure determination

Applicant Wang Meitian
Number 182369
Funding scheme Project funding (Div. I-III)
Research institution Paul Scherrer Institut
Institution of higher education Paul Scherrer Institute - PSI
Main discipline Other disciplines of Physics
Start/End 01.07.2019 - 30.06.2021
Approved amount 216'680.00
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All Disciplines (2)

Discipline
Other disciplines of Physics
Biophysics

Keywords (6)

Macromolecular crystallography; Structure determination; Membrane protein; Native-SAD phasing; X-ray detector; Sample delivery

Lay Summary (German)

Lead
Die dreidimensionale Röntgenstruktur von Biomolekülen liefert grundlegende Einblicke in ihre Funktionen. Die Bestimmung der Phasen mit nativem SAD ist eine direkte und kostengünstige Möglichkeit, diese Strukturen aufzuklären. Das Verfahren beruht jedoch auf einer sehr genauen Messung von Beugungsdaten auf einem Niveau, das gegenwärtig oft nicht erreichbar ist. Wir schlagen einen Ansatz vor, um die Messgenauigkeit durch kombinierte Verwendung von Röntgenstrahlen niedriger Energie, neuartiger Probenzufuhrmethoden und der nächsten Generation von Röntgenkameras (JUNGFRAU) zu verbessern. Falls dies gelingt kann unsere Methode die Erfolgsrate der Strukturbestimmung von Membranproteinen - einer großen Klasse von meist unbekannten, aber biomedizinisch relevanten Biomolekülen - signifikant steigern.
Lay summary

Titel des Forschungsprojekts

Entwicklung von nativer SAD-Phasierung zur Bestimmung der Membranproteinstruktur

Lead

Die dreidimensionale Röntgenstruktur von Biomolekülen liefert grundlegende Einblicke in ihre Funktionen. Die Bestimmung der Phasen mit nativem SAD ist eine direkte und kostengünstige Möglichkeit, diese Strukturen aufzuklären. Das Verfahren beruht jedoch auf einer sehr genauen Messung von Beugungsdaten auf einem Niveau, das gegenwärtig oft nicht erreichbar ist. Wir schlagen einen Ansatz vor, um die Messgenauigkeit durch kombinierte Verwendung von Röntgenstrahlen niedriger Energie, neuartiger Probenzufuhrmethoden und der nächsten Generation von Röntgenkameras (JUNGFRAU) zu verbessern. Falls dies gelingt kann unsere Methode die Erfolgsrate der Strukturbestimmung von Membranproteinen - einer großen Klasse von meist unbekannten, aber biomedizinisch relevanten Biomolekülen - signifikant steigern.

Inhalt und Ziel des Forschungsprojekts

Unser Ziel ist es, die native SAD-Phasierungsmethode zu entwickeln und Membranproteinmikrokristalle zur de novo Strukturbestimmung einzusetzen. Wir planen, unsere Ziele in drei Schritten zu erreichen: (1) Entwicklung des JUNGFRAU-Detektors (JF) für die makromolekulare Kristallographie (MX) im konventionellen Energiebereich; (2) Anwendung von JF auf Röntgenstrahlen niedriger Energie für die Native-SAD-Phasierung; (3) Lösen neuer Membranproteinstrukturen.

Wissenschaftlicher und gesellschaftlicher Kontext des Forschungsprojekts

Die vorgeschlagene Forschung wird weitreichende Auswirkungen auf die Strukturbiologie von Membranproteinen, MX-Datenerhebungsmethoden und die MX-Strahllinienentwicklung haben. Zuallererst erwarten wir, dass das niederenergetische SAD zu einer allgemeinen Methode für die routinemässige de novo Phasierung von Membranproteinen mit hoher Erfolgsrate und niedrigen Kosten wird, was wiederum die strukturelle und funktionelle Untersuchung von Membranproteinen beschleunigt. Aus technologischer Sicht werden wir eine nahezu ideale Detektortechnologie für MX-Anwendungen in Synchrotronstrahllinien weltweit einführen.

Keywords

Makromolekulare Kristallographie, Strukturbestimmung, Native-SAD-Phasierung, Röntgendetektor, Probenzufuhr, Membranprotein

Direct link to Lay Summary Last update: 10.12.2018

Responsible applicant and co-applicants

Employees

Project partner

Associated projects

Number Title Start Funding scheme
177125 Tunable nanosecond laser for time-resolved serial crystallography at SLS and SwissFEL 01.01.2018 R'EQUIP
129584 Phasing of Nucleic Acid Crystal Structures with Phosphorus Anomalous Signal 01.11.2010 Project funding (Div. I-III)

Abstract

The experimental phasing is the last hurdle in macromolecular crystallography (MX). Only when phases are determined, the puzzle of three-dimensional biomolecular structure can be finally solved. Native-SAD is an attractive phasing method with great potentials because it does not require introducing non-biological heavy elements into biomolecules. The success of native-SAD relies on very accurate measurement of diffraction intensities at low energies (<6 keV) where the anomalous phasing signal is enhanced. For this, both data collection method and beamline instrumentation need to be optimized. Recently, we have developed a low-dose multi-orientation data collection strategy for native-SAD at 6 keV, which has dramatically increased the success rate of native-SAD for large crystals diffracting better than 2.5 Å resolution and has been applied to soluble proteins widely. However, the challenge remains for membrane proteins because they often yield weakly diffracting microcrystals, which has hampered the progress of membrane protein structural biology. In response to these challenges, we propose to extend native-SAD to lower energies (3.5 - 5 keV). In this energy range, the anomalous scattering factor f” of sulfur and phosphor, that gives the phasing signal, is significantly higher than in the energy range (6 - 8 keV) typically used in native-SAD currently. The boost in f” increases anomalous phasing signal for native-SAD only if measurement errors are low. The primary source of errors at energy <6 keV are from sample absorption and detector performance. The sample absorption can be minimized by mounting microcrystals in specifically designed sample holders. The performance of current X-ray detectors however progressively deteriorates toward low energies. In particular, their non-uniform response limits data accuracy, which is detrimental to native-SAD. To overcome this limitation, we are currently developing a unique detector technology - JUNGFRAU at the Paul Scherrer Institute (PSI). JUNFGRAU’s excellent uniformity and linearity are ideal for recording diffraction patterns with sharp spots in an utmost accuracy. In the course of the proposed research, we will validate the performance of a novel four million-pixel JUNGFRAU detector (JF4M) at 5 keV X-ray energy at beamline X06DA at Swiss Light Source (SLS), using challenging native-SAD targets. Then we aim at demonstrating the advantage of low-energy native-SAD using 3.75 keV X-rays with membrane protein microcrystals at beamline BL-1A at Photon Factory (PF), Japan. Finally, the low-energy native-SAD will be applied to solve new membrane protein structures. This research will be conducted by two established beamline teams (SLS and PF) in the native-SAD phasing field in a joint effort with PSI detector team with both test and real-life samples provided by long-term collaborators.Once the method is established, we expect that it will lead the MX beamline development in new directions and be adopted at next-generation synchrotron facilities. Such beamline will accelerate the structure determination of membrane proteins, which are essential targets in structural biology and drug discovery in the coming decade.
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